高光谱荧光成像技术在活体医学上的应用

随着科学技术的发展，分子成像技术已经与包括遗传工程模式动物在内的动物研究策略有效地结合在一起。这项技术可以实现无损伤的在动物体内评价代表治疗效果的分子和细胞事件，因此可以利用同一组动物进行长时间的研究，从而大大减少了实验动物的使用数量。更为有力的是，由于一系列的数据来源于同一只或同一组动物，以自身作为内对照，大大增加了数据的可靠性。

通过活体动物体内成像系统，可观测到疾病或癌症的发展进程以及药物治疗所产生的反应，并可用于病毒学研究、构建转基因动物模型、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究以及细胞体外检测等领域。

1 癌症与抗癌药物研究

直接快速地观察各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。精诺真生物成像技术提高了检测的灵敏度，即使微小的转移灶也能被检测到(可以检测到体内100个细胞的微转移)。目前已商品化的肿瘤细胞株包括:前列腺癌，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，子宫颈癌和结肠癌等BiowareTM细胞系模型。Rehemtulla等人采用携带前体药物转化酶和酵母胞咯吮脱氨酶基因的腺病毒载体，运用活体成像技术与磁共振成像技术(magnetic resonance imaging, MRI)研究了其作为转基因治疗药物在癌症治疗中的效果。

2 免疫学与干细胞研究

    将荧光素酶标记的造血干细胞移植人脾及骨髓，可用于实时观测动物活体体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化。有研究表明，应用带有生物发光标记基因的小鼠淋巴细胞，检测放射及化学药物治疗的效果，寻找在肿瘤骨髓转移及抗肿瘤免疫治疗中复杂的细胞机制。应用可见光活体成像原理标记细胞，建立动物模型，可有效地针对同一组动物进行连续的观察，节约动物样品数，同时能更快捷地得到免疫系统中病原体的转移途径及抗性蛋白表达的改变。

近年来，不少报道介绍了应用活体成像技术研究免疫细胞迁移的实例。其一是利用人多发性硬化症的小鼠模型观察实验性自免疫脑脊髓炎中自身抗原反应性CD4+T细胞的迁移模式。包含荧光素酶和GFP基因的逆转录病毒载体处理特定的CD4+T细胞。首先用流式细胞仪分选GFP发光的细胞，然后分别注人对照及实验组动物体内。荧光素酶在活体的发光情况表明标记的CD4+T细胞迁移至中枢神经系统，而GFP可以进一步用于这些细胞的组织学定位。双功能报告基因的应用极大地方便了特定免疫细胞的筛选及迁移研究。

3 细胞凋亡

在正常生理条件下，细胞增殖和凋亡是严格协调的，这种平衡一旦打破，就会导致一系列的疾病，包括AIDS、神经退行性疾病、脊髓炎综合症、缺血/再灌注损伤及肿瘤等等。当荧光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无荧光素酶活性，细胞不能发光，而当细胞发生凋亡时，活化的caspase-3在特异识别位点切割去掉抑制蛋白，恢复荧光素酶活性，产生发光现象，由此可用于观察活体动物体内的细胞凋亡相关事件。

4标记病毒

1. 病毒侵染

以荧光素酶基因标记的HSV-1病毒为例，可观察到HSV-1病毒对肝脏、肺、脾及淋巴结的侵和病毒从血液系统进人神经系统的过程。多种病毒已被荧光素酶标记，用于观察病毒对机体的侵染过程。

2. 基因治疗

基因治疗包括在体内将一个或多个感兴趣的基因及其产物安全而有效地传递到靶细胞。目前，基因治疗主要是以病毒做载体，可应用荧光素酶基因作为报告基因用于载体的构建，观察目的基因是否能够在实验动物体内持续高效和组织特异性表达。这种非侵人方式具有容易准备、低毒性及免疫反应轻微等优点。荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中，用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况。

5标记细菌

    利用细菌荧光素酶基因可以分别标记革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。常用的几十种细菌都已被标记，用来进行细菌侵染和抗生素药物的研究。

    细菌侵染研究：可以用标记好的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌侵染活体动物，观测其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。

抗生素药物研究：利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，医药公司和研究机构可用这种成像技术进行药物筛选和临床前动物实验研究。近年来，国际上大型制药公司纷纷将精诺真技术在动物体内的实验结果作为FDA(美国食品和药品检验局)药物申报材料中非常重要的临床前动物实验部分。

6 基因表达和蛋白质相互作用

1. 组织特异性基因表达

荧光素酶是一类生物发光酶，其中的Renilla荧光素酶和Firefly荧光素醉分别识别不同的底物。一种细胞可被这两种荧光素酶标记：Renilla荧光素酶基因由一组成性稳定表达的启动子驱动，作为内参，反应细胞数量的变化；Firefly荧光素酶基因由需要研究的组织特异性启动子驱动。这样Firefly荧光素酶发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反应特定的启动子在动物体内的表达活性。

2. 蛋白质相互作用

观察细胞中或活体动物体内两种蛋白质的相互作用，是将荧光素酶基因分成两段，分别连接所研究的两种蛋白之一的编码DNA，然后导入细胞或动物体内表达为融合蛋白。当两种蛋白有强相互作用时，表达的荧光素酶两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶，在有底物存在时出现生物发光，反映出所研究的两种蛋白存在相互作用。应用此原理亦可用于研究细胞信号传导途径。

3. 阻断RNA

通过对比生物发光的变化，验证在成年小鼠体内，注射双链siRNA可以特异地阻遏基因表达。

7 转基因动物模型

    为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插人目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，建立转基因动物模型。利用其表达产生的荧光素酶与底物作用产生生物发光，反应目的基因的表达情况，从而实现对目的基因的研究。发育生物学方面可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，药理学研究方面可观察药物诱导特定基因表达，以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。如图3所示。

研究者根据研究目的，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转人动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可用来评估候选药物和其它化合物的毒性，为药物在疾病中的作用机制及效用提供方法。

8 药效评价

对于一些需化学方法进行标记的物质，比如化学合成药物、纳米药物及一些肽段等，只能通过化学合成的方法与荧光染料进行偶连，检测荧光的发光情况，从而实现活体示踪的目的。目前应用较多的是对于一些肿瘤靶向药物在活体内靶点的识别、研究蛋白质-蛋白质相互作用以及跟踪化学药物在体内的分布及代谢情况等。例如用CY5.5及CY7标记RGD肽段，研究其在尾静脉注射不同时间里对移植胶质瘤中细胞粘附分子Intergrin的特异性识别过程。在肿瘤药物相关研究中，用CY5.5标记两种脱氧核糖类似物CY5.5-2DG及CY5.5-NHS均可在小鼠活体水平上直接观测到其对肿瘤的特异性识别作用。

9 监测器官移植

生物发光成像在器官移植的监测方面得到很好的应用。其一是监测与器官移植密切相关的基因表达情况，如肝移植中的血红素加氧酶；其二是利用荧光素酶的标记和示踪功能来揭示移植反应中移植物的动态表现包括排斥和存活情况等。Chen 等将荧光素酶转基因鼠( FVB/NJ- luc)的胰腺移植至野生FVB/NJ 或异源BALB/c 链唑霉素诱导糖尿病鼠体内，利用生物发光系统得到的发光信号来指示体内移植物存活情况，并与体内血糖水平及移植位点组织学结果进行相关性分析，可以得到有价值的信息。

图1 不同荧光染料的激发光谱曲线

图2A 麻醉裸鼠四种染料试制的分布/ 图2B 四种染料试制混合注射到裸鼠体内观测试制分布

图3  注射500 pmol Cy7、Cy7-c(RGDyK)、Cy7-E[c(RGDyK)]2、 or Cy7-E{E[c(RGDyK)]2}2的皮下U87MG肿瘤小鼠在2min、30min、1h、2h、4h、24h时间内的全身NIR荧光成像

图4（A）注射Cy7-RGD 500pmol的U87MG肿瘤小鼠体内NIR荧光成像，实验组和对照组均注射200μg/小鼠c(RGDyK)，箭头代表肿瘤的位置

（B）在2小时后无创成像后解剖的U87MG肿瘤和主要器官和组织的代表性荧光图像。从左到右：U87MG肿瘤，肌肉，肝脏，肾脏和肠